| 1. | 操作原理： | ||
| 培養黴漿菌於黴漿菌培養基中，觀察菌落之生成。此方法是目前最直接與靈敏之步驟，亦是用來評估其他偵測新步驟之標準步驟之一。 缺點為培養時間長，須3~5星期才能判斷。且有些黴漿菌不易在目前之培養基中培養出來 (例如 M. hyorhinis)。 | |||
| 2. | 材枓： | ||
| 2.1 | 黴漿菌培養基 | ||
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2.1.1 dextrose 2.1.2 L-arginine HCl 2.1.3 Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) 2.1.4 horse serum (heat-inactivated, 56℃, 30 min) 2.1.5 15% yeast extract solution (autoclaved) 2.1.6 Bacto agar |
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| 2.2 | 陽性反應對照菌株 | ||
| 2.2.1 Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 2.2.2 Mycoplasma arginini (ATCC 23838) |
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| 2.3 | 附蓋玻璃試管〈16 x 100 mm〉〈已滅菌〉 | ||
| 2.4 | 6 cm 無菌培養皿 | ||
| 2.5 | 厭氧缸與厭氧試劑 | ||
| 3. | 配製培養基： | ||
| 3.1 | 培養基有broth〈液體〉及agar plate〈固體〉二種型式，其基本配方皆為Difco PPLO broth*(60%)、heat-inactivated馬血清(20%)、
15% yeast extract solution (10%)、與 10x stock solution (10%)。由於培養時間長，可加入penicillin(最終濃度為500 units/ml)至10x
stock solution（見3.2）或加入thallium acetate (最終濃度為 1：2000)至培養基中（見3.3 與 3.4），以防止其他細菌污染。 *註：亦可使用 Mycoplasma broth base (Becton-Dickison 11458) 或 Mycoplasma agar base (Becton-Dickison 11456) |
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| 3.2 | 10x stock solution (1 liter) | ||
| 3.2.1 | 稱取 50 g dextrose 和 10 g L-arginine HCl，37℃溶於 1 liter蒸餾水中。 | ||
| 3.2.2 | 以 0.22 μm 無菌過濾膜過濾滅菌。 | ||
| 3.2.3 | 分裝 100 ml至瓶中，保存於 -70℃。 | ||
| 3.3 | Mycoplasma broth (1 liter) | ||
| 3.3.1 | 稱取 21 g 之 Difco PPLO broth，0.02 g phenol red 於 ml 蒸餾水中，加熱攪拌溶解之，滅菌121℃、15 lb、15分鐘。 | ||
| 3.3.2 | 待溫度降低至室溫後，於無菌操作台內加入 200 ml 之 heat-inactivated 馬血清，100 ml 之 autoclaved 15% yeast extract solution，及100 ml 解涷之 10x stock solution，混合均勻後，分裝至已滅菌之有蓋玻璃試管中，10 ml/管。 | ||
| 3.4 | Mycoplasma agar (1 liter) | ||
| 3.4.1 | 稱取 21 g 之 Difco PPLO broth，0.02 g phenol red，15 g Bacto
agar* 於 ml 蒸餾水中，加熱溶解之。
3.4.2. 滅菌121℃，15分鐘。 * 註：或用 Difco PPLO agar 取代 |
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| 3.4.2 | 滅菌121℃，15分鐘。 | ||
| 3.4.3 | 放在 50℃ 水中浴中，待溫度降低至 50℃ 時，於無菌操作台內加入200 ml 之 heat-inactivated 馬血清，100 ml 之 15% autoclaved yeast extract solution 及 100 ml 解凍之 10x stock solution，混合均勻後，倒入無菌培養皿中。 | ||
| 4. | 測試樣品： | ||
| 4.1 | 樣品種類包括冷凍細胞、培養中之細胞、測試血清、培養基或其他細胞樣品等。 若為培養中之細胞，須至少三天以上未更換培養基。若為懸浮型細胞，可直接取樣細胞懸浮液。若為吸附型細胞，取樣前先吸除大部分培養基， 並刮下少許吸附之細胞與剩餘之 3~5 ml 培養基混合後，才進行取樣。 | ||
| 4.2 | 測試樣品應不含抗生素以避免影響測試結果。若測試樣品含有抗生素〈例如冷凍細胞或培養細胞〉，則將收集之細胞懸浮液以離心處理或再用不含抗生素之培養基洗滌 3 次， 以移除任何殘留之抗生素。 | ||
| 5. | 步驟： | ||
| 5.1 | 分別接種測試樣品至 Mycoplasma broth 與 Mycoplasma agar plate 中。 | ||
| 5.2 | Mycoplasma broth：取樣約 0.1 ml~1 ml 測試樣品接種於 Mycoplasma broth 中，置於 37℃ 培養二週，持續觀察是否有混濁或是 pH 值改變之情形。 在培養一週及二週後，分別取樣約 0.2 ml 之 Mycoplasma broth 接種於 Mycoplasma agar plate，將此 agar plate 放入厭氧缸中，加入厭氧試劑後置於 37℃ 培養箱培養〈或是使用5% CO2-95% nitrogen 之厭氧箱〉，培養至少3星期，持續觀察是否有黴漿菌之菌落出現。 | ||
| 5.3 | Mycoplasma agar plate：取樣約 0.2 ml 測試樣品接種於 Mycoplasma agar plate 上，將此 agar plate 放入厭氧缸中，加入厭氧試劑後置於 37℃ 培養箱培養〈或是使用5% CO2-95% nitrogen 之厭氧箱〉，培養至少3星期，持續觀察 agar plate 上是否有黴漿菌菌落出現。 | ||
| 5.4 | 須作正負反應對照組，正反應對照組為 Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 與 M. arginini (ATCC 23838)。負反應對照組為待測細胞之新鮮培養基。 | ||
| 6. | 結果判讀： | ||
| 6.1 | 陽性反應：Mycoplasma agar plate 上有類似荷包蛋(fried- egg like)之細小菌落產生，可在100倍放大倍率之顯微鏡下觀察。 | ||
| 6.2 | 陰性反應：Mycoplasma agar plate 上沒有菌落產生。 | ||
| 7. | 注意事項： | ||
| 7.1 | 黴漿菌生長較慢，所以除了接種 Mycoplasma agar plate 外，亦同時接種於 Mycoplasma broth ，以達增值之作用，於 Mycoplasma broth 增殖一及二週後，再轉移至 agar plate 培 養。需至少培養3星期後，才可斷定是否有黴漿菌污染結果，所以整個測試需五個星期才知正確結果。 | ||
| 7.2 | 典型之黴漿菌菌落類似荷包蛋(fried- egg like)，為圓形無色之細小透明菌落，可藉100倍放大倍率之顯微鏡觀察之。 | ||
| 7.3 | 若要區分細胞樣品造成的類似菌落，可將其自 agar plate 上切下，重新培養於液體培養基中，培養一星期後再種入 agar plate，觀察菌落之形成，或將其自 agar plate 上切下，重新以其他黴漿菌測試〈例如 DNA 螢光染色或 PCR方法〉。 | ||
| 7.4 | 若有非荷包蛋型之菌落出現，需與其他黴漿菌測試方法比對〈例如 DNA 螢光染色或 PCR方法〉，再判定測試結果。 | ||
| 8. | 參考資料：Hay, R.J., Caputo, J., and Macy, M.L. Quality control methods for cell lines, second edition. American Type Culture Collection, Manassas, Virgina. | ||
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資料提供：食品工業發展研究所 生物資源保存及研究中心 |
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