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細胞株之複核--同功酵素圖譜分析

1.0 原理：
 
1.1 同功酵素，是指催化同一化學反應，但在結構與物理特性方面有所不同的一群酵素，其特性方面的差異可明顯的表現在電泳分離時酵素分子間之相對距離上。
1.2 某些同功酵素具有基因多形性（polymorphism）之特性，來自不同種源之生物體，或同一生物體的不同組織，甚至同一種源同一組織之不同個體具有不同形式之同功酵素分布。
1.3 同功酵素經由電泳分離並以酵素基質反應並呈色作用後，呈顯不同位置之同功酵素圖譜，此圖譜稱之為Zymography，經由對細胞株Zymography圖譜作分析，即可得知該細胞株之種源和其正確性。

2.0 材料與設備
  2.1 Cell Extraction Buffer : 4℃下保存。（INNOVATIVE CHEMISTRY）
2.2 酵素穩定劑（Enzyme Stabilizer Solution）：每Enzyme Stabilizer vial 加入1mL dH2O溶解，貯存於－20℃下，可保存一年。
2.3 對照組（Standard / Control）：Standard（NCTC clone 929）或Control（HeLa S3） lyophilized vial加入0.1mL酵素穩定劑，稀釋溶解，分裝10ul /tube，貯存於－20℃下，可保持一年，回溫解凍20次仍不失活性。
2.4 電泳液Electrophoresis buffer (0.05M, SAB plus buffer, pH 8.6 ): 一瓶裝25g SAB plus 8.6 buffer powder溶於2L dH2O，攪拌均勻待其完全溶解，約1hr，4℃下可保存6個月。
2.5 活性測定之酵素基質溶解液0.1M SAB plus buffer：
2.6 真空抽氣瓶裝置
2.7 無菌phosphate-buffer saline , D-PBS（GIBCO 21-010）
2.8 無菌trypsin / EDTA：0.05% trypsin-0.53mM EDTA（GIBCO 25300-062）
2.9 無菌15ml離心管
2.10 無菌吸管（pipette）5ml, 10ml
2.11 電動吸管器（pipetacu）
2.12 低溫高速離心機
3.0 細胞的收集：多於107 細胞製備，預估生長至高緻密度（confluence）的T-75 flask，大約含有大於107 個細胞。
  3.1 附著型細胞（attachment cell）
3.1.1 將confluent T-75 flask中原有培養基吸出8 ml，置於15 ml離心管中備用，其餘的培養基以真空抽氣瓶裝置抽除。
3.1.2 T-75 flask以無菌吸管加入8 ml D-PBS，洗滌（rinse）細胞一至二次，並抽掉D-PBS。
3.1.3 加入1～2 ml trypsin∕EDTA溶液（目的：使細胞由flask上脫離），於倒立顯微鏡下觀察，當細胞呈圓粒狀時（室溫下作用數分鐘），抽掉溶液。
3.1.4 拍擊flask瓶壁，使細胞與flask分離後，立即加入3.1.1預留8 ml的培養基含有血清的培養基，混合均勻，以中和trypsin/EDTA的作用。
3.1.5 將懸浮的細胞液轉移至15 ml離心管。
3.1.6 離心（轉速1,000 rpm) 5分鐘。
3.1.7 以真空抽氣瓶裝置，吸除上層培養基，留下沈澱的細胞。
3.1.8 加入8 ml cold D-PBS，重新將細胞懸浮於15ml 離心管中。
3.1.9 離心（轉速1,000 rpm) 5分鐘，盡可能將上層D-PBS溶液完全抽除，僅留下沈澱的細胞。（殘留的鹽溶液，將會影響後續的蛋白酵素的萃取效果）
3.2 懸浮型之細胞
3.2.1 同步驟3.1.5至3.1.9
4.0 細胞蛋白質之抽取：
 
4.1 將15 ml離心管中約107的細胞，重新懸浮於等體積的Cell Extraction Buffer（約40～100 ul），並移至1.5 ml微量離心管中，均勻混合（pipetting, up and down）但不要產生氣泡。
4.2 置於冰上作用30分鐘。
4.3 4℃下離心（轉速10,000 rpm）10min。
4.4 細胞沈澱物不要，將上清液(含細胞酵素)轉移至新的1.5ml微量離心管，加入等體積之酵素穩定劑（Enzyme Stabilizer，使final conc. of Enzyme soln：200mg/mL）混合均勻，置於－20℃，可保存一年至三年。

5.0 細胞酵素活性測定
  5.1 材料：
5.1.1 酵素基質(Enzyme Substrate)：
5.1.1.1 NP (Nucleoside Phosphorylase)基質
5.1.1.2 G6PD (Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase)基質
5.1.1.3 MD (Malate Dehydrogenase)基質
5.1.1.4 LD (Lactate Dehydrogenase)基質
5.1.2 活性測定之酵素基質溶解液：0.1M SAB Plus Buffer
5.1.3 Quench-a-Zyme Reagent
5.1.4 計時器Timer
5.1.5 恆溫水浴槽Water Bath : (37℃)
5.1.6 2.5ml 針筒
5.1.7 1.5 ml 微量離心管
5.1.8 微量吸管Tip：20 ul，200 ul，1000 ul
5.1.9 Pipetman：P20，P200，P1000
5.1.10 微量離心管架
5.1.11 disposable cuvette
5.1.12 分光光譜儀Spectrophotometer ( A565 nm )
5.1.13 酵素活性∕電泳膠片記錄紙（Form 1）

5.2 活性測定
5.2.1 酵素基質置備：取出4℃保存之酵素基質(Enzyme substrate) vial（NP, G6PD, MD,或LD），利用2.5 ml針筒加入4℃保存之2.5 ml 0.1M SAB plus buffer (活性測定之酵素基質溶解液) 溶解，酵素基質溶液可在冰上保持3hr。
5.2.2 準備1.5 ml微量離心管，在管壁及管蓋上標示待測樣品資料，及1管不加酵素之空白對照組(Blank)。
5.2.3 每一微量離心管加入100 ul酵素基質溶液，將全數的為微量離心管置於37℃恆溫水槽中回溫2分鐘。
5.2.4 依序加入10 ul待測細胞酵素萃取液混合均勻，而空白對照管(Blank)中加入ddH2O。37℃反應10分鐘（剛好10分鐘整）。（為了確實每一管都作用10分鐘，可間隔20或30秒，加入下一個樣品進行反應）
5.2.5 作用10分鐘後，立即加入1 ml Quench-A-Zyme混合均勻，終止酵素的作用，使其呈色。（每一管的終止反應間隔時間，同步驟5.2.4的20或30秒），並記得同樣加入1 ml Quench-A-Zyme於標示"Blank"之不加酵素的空白對照組(Blank)。
5.2.6 將微量離心管中的呈色的反應物，移入disposable cuvette中。
5.2.7 以光譜分析儀，測定每一管的OD 565吸光值。（扣除Blank管的吸光值）
5.2.8 細胞萃取液中待測酵素活性之可分析範圍如Table 1所示。當細胞萃取液反應後的OD 565吸光值高於表中的最大值時，表示細胞中的酵素活性過高，此時加入酵素穩定劑加以稀釋；如果OD 565吸光值低於表中的最低值，表示細胞中的酵素活性過低，避免在電泳呈色中無法肉眼檢視，此時可將細胞萃取液濃縮或是在進行電泳分離時增加樣品體積以提高單位活性。

5.3 計算全活性（Total activity）:
5.3.1 在進行電泳分析前，計算每一個樣品的全活性及應注入電泳膠片的體積（ul）。一片電泳膠片上，可分析8個樣品，扣除應放置的Standard與Control兩個對照組，尚可分析6個待測未知樣品。
5.3.2 選擇一個最低活性樣品，以該樣品可被分析的最多全活性total activity（膠片孔洞約可注入1ul ~2 ul的體積）為基準；在相同的全活性下，計算其他樣品的取樣體積。作為電泳分析時加入膠片中的劑量。並將預定分析劑量記錄於記錄紙上(Form 1)。
  Table 1 : Maximum and Minimum Activity Levels Required for Electrophoretic Analysis, Using 1 microliter of Sample（From INNOWHTIVE, The AuthentiKit System）
 
Enzyme MaximumActivity MinimumActivity
  A565 IU∕L A565 IU∕L
NP 0.5 500 0.1 100
G6PD 0.7 700 0.1 100
MD 0.9 900 0.1 100
LD 1.2 1200 0.1 100

6.0 同功酵素電泳分析
  6.1 材料：
6.1.1 碎冰／冰桶
6.1.2 37℃恆溫箱
6.1.3 55℃ 烘箱（gel-dryer）
6.1.4 溫控電泳槽：含上層溫控注冰槽和下層電泳槽。
6.1.5 定時電源輸出器（160 volts DC）
6.1.6 Tip／Pipetman：2 ul, 200 ul／P2, P200
6.1.7 電泳液Electrophoresis buffer：0.05 M, SAB plus buffer, pH 8.6，4℃保存。
6.1.8 Agarose gels：室溫保存，不可低溫保存。
6.1.9 Standard and Control：-20℃保存。
6.1.10 Enzyme Stabilizer：-20℃保存。
6.1.11 電泳膠片呈色基質(Enzyme substrate)溶液：溶於0.5 ml ddH2O，可在冰上保持6 hr。
6.1.12 5 ml pipet
6.1.13 清洗槽（de-stain holder）
6.1.14 膠片清洗液：Deionized water

6.2 電泳分析
6.2.1 37℃incubator與55℃Gel Dryer打開電源，溫機。
6.2.2 將溫控電泳槽上層的注冰槽中充滿碎冰（4℃～10℃）。
6.2.3 電泳槽的正負兩極槽各加入95 ml電泳液（0.05 M SAB plus buffer），令兩極的電泳液呈相同的高度。兩極間分隔區應擦乾。使用過的電泳液其酸鹼值明顯改變，不再回收使用。
6.2.4 取出一片電泳膠片及記錄紙，先於記錄紙上依次標示各待測樣品的編號名稱。由左而右依序為Standard，Control，樣品1，樣品2，樣品3，樣品4，樣品5，樣品6。
6.2.5 膠片上由左而右，依照記錄紙上的標示樣品順序和5.2.10計算的劑量，使用P2 pipetman/ Tip取樣，並小心加入各個孔洞中。
6.2.6 再將膠片依照正負極方向，放入電泳槽上層之恆溫槽中，蓋回電泳槽上。
6.2.7 使用定時電源輸出器，設定輸出時間25分鐘。（每次電泳分離的時間必須精確的控制為25分鐘，如此結果才能與Standard和Control對照組比較。）

6.3 活性染色：
6.3.1 預先以針筒將0.5 ml ddH2O加入1瓶酵素基質，混合溶解。
6.3.2 電泳後的膠片取出，以P200 Pipetman分次均勻淋上500ul酵素基質溶液，並以5 ml乾淨Pipette均勻抹散。
6.3.3 37℃恆溫箱靜置10～30分鐘，基質溶液與酵素作用後會出現反應帶(bands)，由反應帶出現的快慢調整作用的時間。

6.4 褪染：
6.4.1 在清洗槽（de-stain washer）中，加入300 ml去離子水。
6.4.2 將呈色完全的膠片放入300ml去離子水中褪染，上下振盪10分鐘，清洗2次。

6.5 烘乾：
6.5.1 完全褪染後的膠片，移入55℃ 烘箱中烘乾60分鐘。
6.5.2 將膠片貼在預先標示之記錄紙上，並記錄反應過程中各項條件

7.0 結果判讀：
 
7.1 取出貼上的膠片之記錄紙（Form1），計算（依記錄紙上的刻度，肉眼目視）8個樣品的酵素呈色反應帶(band)所移動的位置(mm)，記錄於Form 2上。
7.2 利用Form 2的公式表格。比對已知Standard / Control的位移比例，計算待測樣品的正確位移。
7.3 在Form 3表中，將各個樣品所分析的4種同功酵素的移動位移±2mm之數值，在下方種源分析總表中圈選出來，4種同功酵素位移的交集，即為該樣品可能的種源。
 
(from Innovative chemistry : Authentikit system)
 
Subset Columns
Standardized Migrations 		NP1
Subset		 G6PD2
Subset		 MD3
Subset 		MPI4
Subset		 PEP B5
Subset 		AST6
Subset		 LD7
Subset
Set of Possible Species              
Spodoptera ( Sf9 ) Null -4.5 0.2 19.0 19.9, 15.4 21.5 13.0
Dog 10.6 13.0 11.2 9.4 16.1 10.2 -4.4, 3.8, 11.1, 18.1, 21.9
Pig 10.8 10.8 13.2 16.2 25.8 13.0 0.05, 7.4, 14.7, 22.0, 29.4
Monkey, Cercopithecus 11.3 15.0 8.6 12.6 12.4 12.6 -5.2, 2.9, 10.2, 18.3, 24.9
Fox 11.4 13.9 12.1 6.7 18.0 9.4 -1.5, 6.3, 13.5
Rat 11.5 18.7 12.2 9.8 16.2 10.2 -4.9, 3.0, 10.9, 16.6
Horse 12.4 - - - - - - 27.9 12.1 -0.9, 5.9, 12.4, 18.9, 28.1
Human B 12.8 12.1 8.3 12.9 12.4 15.0 -5.0, 3.0, 10.6, 18.7, 26.9
Human A 12.9 14.5 8.3 12.9 12.4 15.0 -5.6, 2.8, 10.6, 18.5, 24.8
Cat 16.4 9.5 12.4 13.5 20.1 10.5 -4.3, 2.0, 7.8, 13.8, 20.1
Aoudad 17.2 10.4 12.1 11.0 28.3 10.3 0.7, 4.9, 9.2, 13.9, 18.9
Raccoon 17.5 10.4 13.9 - - - - 13.4 -0.4, 7.0, 13.5, 20.5
Guinea Pig 18.7 18.5 10.4 11.6 17.8 12.0 -0.7, 6.5, 13.4, 20.7
Baboon 18.8 15.7 10.4 12.5 15.9 13.7 -5.6, 2.8, 10.6, 18.0, 26.3
Bat 19.7 8.9 5.6 12.8 11.3 10.0
-7.0, -1.1, 5.3, 12.0, 16.1
Buffalo 19.7 9.6 16.5 - - - - 10.2 - -, 3.0, 8.2, 12.6, 17.4
Monkey, Rhesus 20.0 15.0 8.6 13.7 - - 12.7 -5.5, 3.0, 11.6, 20.8, 28.7
Mink 20.0 13.5 12.9 10.4 18.5 8.8 0.2, 7.0, 13.6, 21.0
Hamster, Syrian 21.4 17.5 11.6 10.9 16.5 12.4 4.7
Hamster, Chinese 23.0 16.9 13.2 13.7 16.5 11.8 6.1
Bovine 23.1 9.7 13.0 9.0 18.0 9.1 1.2, 6.0, 10.6, 15.8, 21.3
Rabbit 25.1 12.3 9.9 14.3 4.7 14.6 0.2, 5.5, 10.7, 16.7
Mouse 25.2 18.1 12.0 16.8 8.0 10.0 5.5, 9.7, 12.8

 
資料提供：食品工業發展研究所 生物資源保存及研究中心
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