實驗方法 | 國家衛生研究院細胞庫

細胞繼代培養

1.	前言：
	1.1	細胞生長至高密度時，即須收集細胞，分殖至新的培養瓶中，其稀釋比例依細胞種類而異。
	1.2	收集細胞方法可用trypsin-EDTA、cell scraper、離心處理等，處理方法依細胞種類而異。
	1.3	Trypsin-EDTA為收集吸附型細胞常用之方法。Trypsin為胰蛋白酵素，其作用為分解細胞與瓶壁之附著蛋白， EDTA為chelating agent，其作用為去除Ca²⁺、Mg²⁺等離子，trypsin與EDTA二者共同作用，可使附著之細胞自瓶壁脫落。除了trypsin-EDTA，亦可使用cell scraper(細胞刮勺)刮落細胞。
	1.4	Trypsin-EDTA作用時間勿太久，否則可能對細胞造成傷害或死亡。敲拍培養瓶不可太過猛烈，避免對細胞造成傷害或造成培養瓶裂痕而污染。

2.	材料：
	2.1	Dulbecco's phosphate-buffered saline, Ca⁺⁺/Mg⁺⁺ free
	2.2	trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA.4Na)：若為大體積包裝，建議將其以少量分裝於無菌試管中，保存於-20℃，避免反覆冷凍解凍造成trypsin之活性降低，並可減少污染之機會。使用前放在37℃水槽中回溫。
	2.3	新鮮培養基
	2.4	無菌吸管/離心管/培養瓶

3.	步驟：
	3.1	附著型細胞(adherent cell)
		3.1.1	吸掉舊培養液。
		3.1.2	用Dulbecco's phosphate-buffered saline洗滌細胞一至二次。
		3.1.3	加入trypsin-EDTA溶液(1ml/T-25 flask, 2ml/T-75 flask)：
			3.1.3.1	方法一：37℃或室溫作用數分鐘，於倒立顯微鏡下觀察，當細胞將要分離而呈現圓粒狀時，吸掉trypsin-EDTA溶液，輕敲培養瓶邊緣使細胞自瓶壁脫落，然後加入適量之新鮮培養基，與脫落之細胞或細胞團塊混和均勻後，依稀釋比例轉移至新的培養瓶中，依正常條件繼續培養之。
			3.1.3.2	方法二：37℃或室溫作用數分鐘，待細胞自瓶壁脫落後，加入適量含血清之新鮮培養基，以終止trypsin作用﹙因血清中含有trypsin inhibitor，可以終止trypsin作用﹚，離心後去除上清液，或不作離心處理，添加新鮮培養基後依稀釋比例轉移至新的培養瓶中，依正常條件繼續培養之。
	3.2	懸浮型細胞(suspension cell)
		3.2.1	吸出細胞培養液，放入離心管中，離心1000 rpm、 5分鐘。
		3.2.2	吸除上清液，加入適量之新鮮培養基，與沉澱細胞(cell pellet)混和均勻後，依稀釋比例轉移至新的培養瓶中，依正常條件繼續培養。
	3.3	融合瘤﹙hybridoma﹚
		3.3.1	有些hybridoma cell需培養三天以上才會產生抗體，若是更換培養基，則可能會失去抗體。因此繼代培養不需離心後更換培養基，直接添加新鮮培養基稀釋細胞濃度即可。


資料提供：食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心

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